人非小細胞肺癌裸鼠原位種植轉移模型的建立：（1）探討肺癌遠處轉移和阻斷其遠處轉移的研究；（2）模擬晚期非小細胞肺癌轉移的自然發(fā)生過程；（3）在活體動物的完整器官內評估瘤細胞播散和腫瘤的生長。

實驗方法原理         

將表達GFP的質粒pRNAT-U6/Neo轉染人肺腺癌細胞A549，G418篩選獲得穩(wěn)定表達GFP細胞，對比轉染前后細胞的生長活性和成瘤性。將轉染后細胞原位種植裸鼠預定標準處死。HE染色和免疫組化檢測轉移灶的位置和數目。利用KODAK  IS2000MM系統(tǒng)檢測腫瘤播散情況。

實驗材料         

BALB c nu nu裸鼠腺癌細胞株A549

試劑、試劑盒        

小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液pRNAT-U6 Neo磷酸鈣即用型SP超敏 感免疫組化染色試劑盒DAB Kit 顯色試劑盒甲醛EDTA

儀器、耗材     

熒光顯微鏡光學顯微鏡

實驗步驟     

一、實驗材料準備

1.  BALB/c nu/nu裸鼠40只，雄性，4-6周齡，體重18-20 g，無特定病原體(SPF)級飼養(yǎng)。

2.  肺腺癌細胞株A549，用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibcobrl公司)，5% CO237℃培養(yǎng)，常規(guī)傳代。

3.  質粒和篩選藥物質粒pRNAT-U6/Neo(美國Genscript公司)，攜帶Neomycin耐藥基因供篩選，在CMV啟動子控制下編碼cGFP作為轉染標記物。G418(美國Promega公司)800 μg/ml初篩后200 μg/ml維持篩選。

二、細胞的轉染

1.   哺乳動物磷酸鈣轉染系統(tǒng)(美國Promega公司)，按照操作指南將質粒pRNAT-U6/Neoo轉入A549細胞，轉染后24~48 h熒光顯微鏡下觀察轉染效率。

2.  后培養(yǎng)液內加G418篩選獲得穩(wěn)定轉染。

3.  利用平板克隆形成試驗測定細胞克隆形成率>10%后，有限稀釋法獲得表達GFP陽性細胞。

4.  1月后收獲轉染細胞，常規(guī)傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加G418(200 μg/ml)維持篩選。

5.  測定轉染后A549細胞增殖動力學指標，對比轉染前后A549細胞生長曲線，檢測轉染后細胞的生長活性是否受轉染的影響。

6.  待細胞增殖達一定數量后，裸鼠皮下注射轉染前后細胞，記錄成瘤時間，用公式V=1/2×長×寬 計算腫瘤體積，對比轉染前后兩組裸鼠的瘤體大小以檢測成瘤性是否有差別。

三、人肺腺癌A549裸鼠原位種植模型的建立

1.  取轉染后細胞，用不含血清的RMPI 1640培養(yǎng)液沖洗2次并調整細胞最終濃度為5×106/0.2 ml備用。

2.  用0.5%的麻醉50 mg/kg)(中國醫(yī)藥上?；瘜W試劑公司)腹腔注射麻醉裸鼠，用26號針頭吸取細胞懸液0.2 ml注射入裸鼠左側胸腔，注射過程中注意控制刺入針頭的深度。

3.  整個操作過程在細胞收獲后半小時內完成，嚴格遵循無菌原則。

4.  注射后在KODAK IS2000MM下確認原位種植成功，注射部位為胸腔。

5.  注射后繼續(xù)飼養(yǎng)，隔天觀察一次并記錄體重。

6.  當裸鼠出現(xiàn)精神萎靡、呼吸短促、弓背并明顯消瘦，體重較注射Et減輕20%時，頸椎脫位術處死裸鼠。

7.  開胸觀察，取出器官，用10%甲醛固定保存。

四、檢查項目

1.  轉染后細胞熒光顯微鏡成像轉染后24～48 h熒光顯微鏡下觀察，確認轉染成功。單克隆化過程中鏡下觀察細胞克隆生長情況。

2.  活體GFP標記成像檢測應用KODAK IS2000MM進行活體熒光成像，確認注射部位為胸腔，后間斷應用以活體確認瘤細胞的遠處轉移。

3.  解剖學與組織學檢查處死的裸鼠均經

詳細解剖學檢查，取出器官、固定包埋后，以4 tun厚度連續(xù)切片，切片嚴格編號，奇數號行HE染色，光鏡觀察，以初步確定轉移灶。

4.  免疫組織化學染色

選擇肺臟、肝臟和腦作為主要研究器官，在HE染色確定轉移灶位置的基礎上，取相鄰偶數號碼的切片進行免疫組化檢測，CEA鼠抗人單克隆抗體(ZM-0062)，LRP鼠抗人單克隆抗體(ZM．0335)工作液，即用型SP超敏感免疫組化染色試劑盒(sP-9000)、抗原修復液、DAB Kit顯色試劑盒(zU一9032)均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

五、統(tǒng)計學處理

細胞的生長活性和腫瘤體積x±s表示，數值的比較采用方差分析。HE檢測結果和活體成像檢測結果的比較用x2檢驗。采用SPSSl3．0軟件進行統(tǒng)計分析。